Vamos a conocer algunas de las técnicas de análisis de ADN que pueden utilizarse, y así entender mejor los estudios de investigación del tema. No pretendo profundizar en un tema tan complejo, pero sí orientar un poco en que se basa cada una. A fines prácticos de revisión, he decidido ordenarlos alfabéticamente para así facilitar cualquier consulta rápida.
AMPLIFICACIÓN DEL ADN (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), se fundamenta en la propiedad de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN. Se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. Asi es posible obtener millones de copias de un único fragmento de ADN y disponer de suficiente material genético para un posterior estudio molecular. Todo el proceso está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. De esta manera, esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN.
ANTICUERPOS MONOCLONALES
Los anticuerpos monoclonales, son anticuerpos quiméricos (es decir, que sea a la vez humano y animal), realizados por ingeniería genética, para que el sistema inmune humano no lo rechace al ser dirigidos a células de interés. En estos se mantienen los dominios variables de la inmunoglobulina del animal. Existen también los anticuerpos humanizados donde sólo se cambia la zona de unión al antígeno. Actualmente, se conoce la tecnología necesaria para la producción de anticuerpos en ausencia de inmunización del animal. Es la denominada tecnología de los anticuerpos recombinantes.
Los anticuerpos monoclonales se utilizan en muchos campos de la investigación biomédica como identificación y clonación de genes, identificación y aislamiento de proteínas, activación de enzimas, conocimiento de la estructura molecular y morfogénesis; diagnóstico en medicina, gracias a la gran especificidad y capacidad prácticamente ilimitada de los anticuerpos monoclonales para reconocer cualquier estructura química, permitiendo la detección de hormonas, vitaminas, citocinas; la monitorización de drogas, detección de enfermedades infecciosas en microbiología; la detección de alergenos en alergia, hematología, marcadores tumorales e infartos de miocardio, aplicaciones forenses, etc. También tienen aplicaciones terapéuticas, que constituyen el campo más importante de los anticuerpos monoclonales, ya que son capaces de destruir células, incluidas las tumorales, mediante distintos mecanismos. Se emplean en el tratamiento de diversas enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide, el cáncer o para evitar el rechazo tras un trasplante.
ARRAYS DE ADN
Los chips o arrays de ADN consisten en múltiples fragmentos de ADNc (cada uno de los cuales representa un gen diferente) adheridos a un soporte físico concreto (vidrio, plástico, silicona, etc.) y agrupados de manera ordenada (filas y columnas) según su función (receptores, hormonas, factores de transcripción, citocinas, etc.). Para estudiar la expresión génica, se extrae RNA de las células, se convierte a ADNc marcándolo con un colorante fluorescente y luego se hibrida sobre la membrana que tiene los ADN marcados en orden. Tras lavar la superficie, en aquellos puntos donde se haya producido la hibridación por complementariedad de bases, se detectará la marca fluorescente, y de ese modo, sabremos que esos son los genes que se expresan en las células. Su principal ventaja con respecto a las técnicas de biología molecular como la PCR es que pueden detectarse en un único procesamiento, miles de genes.
Este método es el utilizado en nuestro Instituto para determinar los genes determinantes de ciertas características que puede presentar el sujeto en estudio.
BLOTTING: SOUTHERN, NORTHERN, WESTERN
Southern blotting: consiste en separar fragmentos de ADN en gel, transferirlos a una lámina de nylon, desnaturalizarlos (pasan a ADN monocatenario) e hibridar con una sonda que solo se fijará si la secuencia buscada está presente.
Northern blotting: es una técnica similar a la anterior, pero aquí la molécula que se transfiere es ARN, sin necesidad de desnaturalizar.
Western blotting: consiste en separar proteínas por electroforesis, transferirlas a una lámina y localizar las que buscamos por medio de anticuerpos específicos (que se comportan como una sonda).
DNASAS DE RESTRICCIÓN
Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen. Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones). Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula.
Aplicaciones de las enzimas de restricción:
1. Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.
2. Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern Blot”.
3. Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en “Southern”y “Northern” blotting.
4. Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de DNA recombinante
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
La espectrometría de masas es una técnica experimental que permite la medición de iones derivados de moléculas. El espectrómetro de masas mide razones carga/masa de iones, calentando un haz de material del compuesto a analizar hasta vaporizarlo e ionizar los diferentes átomos, el haz de iones produce un patrón específico en el detector, que permite analizar el compuesto. La sensibilidad de estos sistemas permite calcular la masa con una resolución inferior al Dalton (la masa del protón), y esto es suficiente para distinguir no sólo entre varias proteínas, sino también entre diferentes modificaciones post-transduccionales como fosforilación, acetilación, glicosilación, etc.
GENETICA INVERSA
Hoy en día el término genética inversa se utiliza para expresar el descubrimiento de la causa de una enfermedad hereditaria, empezando por el gen responsable hasta llegar a la enzima defectuosa. Así, partiendo del conocimiento de un fragmento de ADN clonado o secuenciado investiga sobre su función biológica alterando dicho ADN mediante mutación, generalmente a nivel masivo. Dicha mutación puede ser puntual, por sustitución de nucleótidos, o más drástica, por ejemplo mediante silenciamiento de genes completos.
HIBRIDACIÓN IN SITU
La técnica de hibridación in situ está basada en la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridarse entre sí, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADN o ARN, que resulta complementaria con otra secuencia.
Su utilidad reside en la capacidad de poder demostrar mediante la utilización de una sonda (formada por una secuencia de ADN previamente conocida) marcada con un isótopo radiactivo, la presencia de determinada secuencia de ADN o ARN complementaria, en la muestra a estudiar. Es muy útil, por ejemplo, para identificar la secuencia de nucleótidos, en determinadas enfermedades de origen genético.
Para estudiar la presencia de genes concretos en el ADN, se puede realizar la hibridación sobre el núcleo interfásico o sobre cromosomas en metafase; en este último caso podemos localizar en que cromosoma, brazo y banda se encuentra el locus del gen estudiado. Igualmente podemos visualizar cuantas copias de un cromosoma se encuentran en cada núcleo y detectar fácilmente monosomías y trisomías.
SONDAS MOLECULARES
Una sonda es un fragmento de ADN o raramente ARN de pequeño tamaño normalmente entre 100 y 1000 bases usado en biología molecular como herramienta para detectar la presencia de ADN o ARN de secuencia complementaria parecida o igual. Para visualizar las moléculas diana se utiliza una sonda marcada, bien radiactivamente, bien mediante marcaje inmunológico. Para el uso de ADN de doble cadena primeramente es necesario desnaturalizarlo mediante calor o en condiciones de alta alcalinidad. Esta sonda de cadena simple marcada se une a la diana; y los lugares de unión se detectan porque los métodos de marcaje dejan una señal detectable mediante fotografía. Se forma asi una estructura bicatenaria, una de las hebras pertenece a la sonda, y la otra a la secuencia diana. Esta unión se establece porque tanto la sonda como la diana tienen secuencias en parte o totalmente complementarias, formándose pares de bases complementarias.
Hasta aquí el pequeño resumen de los análisis genéticos, que pronto nos valdrán para comprender mejor los estudios de investigación que posteriormente discutiremos en este blog.
